Вікіпэдыя

Стрэптавідын

Стрэптавідын (ад анг. streptavidin; strept- «які належыць да стрэпта») — бялок бактэрыяльнага паходжаньня, негліказілаваны гоматэтрамэр з малекулярнай масай 56—70 кДа, які мае высокую афіннасьць да вітаміна Н (біяціну) (Кd=5,5x10-13 М). Дзякуючы наяўнасьці ў кожнай субадзінцы па адным біятынзьвязваючым цэнтры, стрэптавідзін шырока выкарыстоўваецца ў якасьці пасродніка пры злучэньні дзьвюх ці некалькіх каньюгаваных зь біяцінам аб’ектаў (бялкі, нуклеінавыя кіслоты, вузы і інш.).

Прадуцэнты стрэптавідзіна

рэдагаваць

Прыроднымі прадуцэнтамі стрэптавідзінаў зьяўляюцца акцінаміцэты роду Streptomyces сямейства Streptomycetaceae парадку Actinomycetales [90][1]. Уласна стрэптавідзін як бялок, які зьяўляецца часткай унікальнага сінэргічнага антыбіятычнага комплексу, быў упершыню вылучаны з культуральнай вадкасьці (КВ) віда S. avidinii у 1964 г. [91][2]. Нашмат пазьней, у 1985 г., падобная актыўнасьць была знойдзена яшчэ ў аднаго віду — S. venezuelae, пры гэтым біяцінзьвязваючыя бялкі ў складзе антыбіятычнага комплексу, падобныя на стрэптавідзін з S. avidinii, прадукавалі толькі штамы Tu 2460 і Tu 2605. Адпаведныя бялкі былі названыя стрэптавідзін v.1 і стрэптавідзін v.2. Іх першасныя пасьлядоўнасьці маюць высокую ступень гамалёгіі са стрэптавідзінам, прычым захоўваюцца ўсе кансэрватыўныя амінакіслотныя рэшткі, неабходныя для функцыянальнай актыўнасьці [92][3]. Біясынтэз стрэптавідзіна не зьяўляецца таксанамічнай прыкметай. Па-першае, не ва ўсіх штамаў аднаго віда S. venezuelae прысутнічае здольнасьць сынтэзаваць стрэптавідзін. Па-другое, у S. lavendulae, віда значна бліжэйшага да S. avidinii, таксама адсутнічае сынтэз якога-небудзь біяцінзьвязваючага бялка [92][3]. Упершыню ген, які кадуе поўнапамерную форму стрэптавідзіна, быў клянаваны і сіквеніраваны ў 1986 годзе [93, 94][4][5]. З таго часу былі распрацаваныя разнастайныя сыстэмы для экспрэсіі стрэптавідзіна. Часьцей за ўсё для атрыманьня рэкамбінантнага стрэптавідзіна выкарыстоўвалі бактэрыі, асабліва Escherichia coli. Выкарыстаньне цытаплязматычнае экспресійнае сыстэмы (Т7 РНК-палімэраза/Т7 прамотар) E. coli прыводзіць галоўным чынам да назапашваньня нерастваральнага стрэптавідзіна ў цялятах уключэньня, што патрабуе дадатковых стадыяў рэнатурацыі і ўскладняе далейшае вылучэньне актыўнага бялку [95][6]. Растваральную форму бялку атрымлівалі з дапамогай хімерных генэтычных канструкцыяў, якія зьмяшчаюць сыгнальны пептыд OmpA у клетках E. coli [96][7], а таксама ў гетэралягічных сыстэмах экспрэсіі на аснове вузаў вусякі Spodoptera frugiperda [97][8], тытуню і яблыні [98][9]. У адрозьненьне ад папярэдніх дасьледваньняў, дзе стрэптавідзін звычайна атрымлівалі ў форме "ядра" (анг. core), быў таксама атрыманы растваральны поўнапамерны мутантавы стрэптавідзін у цытаплазьме E. coli [99][10]. Акрамя таго, для атрыманьня растваральнага стрэптавідзіна распрацавана эфэктыўная экспрэсійная сыстэма ў Bacillus subtilis [100][11].

Будова малекулы стрэптавідзіна. Структура комплекса біяцін-стрэптавідзін

рэдагаваць
 
Манамэрны стрэптавідзін (ribbon diagram) у комплексе зь біяцінам (spheres)

Па структурных і функцыянальных уласьцівасьцях стрэптавідзін адносяць да вялікага супэрсемейству каліцынаў. У яго ўваходзяць разнастайныя невялікія па памерах пазаклеткавыя бялкі, якія зьвязваюць нізкамалекулярныя гідрафобныя ліганды. Дзьве спэцыфічныя групы каліцынавае сям’і, ліпакаліны і авідзіны, маюць падобную {beta}-складкавую структуру, якая складаецца зь васьмі антыпаралельных ?-атосаў. Бактэрыяльны бялок стрэптавідзін уяўляе сабою негліказіліраваны гоматэтрамэр, які сакрэтуецца глебавымі бактэрыямі S. avidinii (гл. вышэй). Кожны з манамэраў здольны некавалентна зьвязваць па адной малекуле вітаміна Н (біяціну) з высокай афіннасьцю (Кd=5,5х10-13 М). Біяцін, асноўны ліганд стрэптавідзіна, зьяўляецца актыўным кампанэнтам біяцыціну — прастэтычнай групы фэрмэнтаў, якія каталізуюць рэакцыі карбаксіліраваньня. Стрэптавідзін-біяцінавыя комплексы, дзякуючы сваёй высокай стабільнасьці, шырока выкарыстоўваюцца ў разнастайных біятэхналягічных працэсах і сыстэмах.

Малекулярныя характарыстыкі стрэптавідзіна

рэдагаваць
 
Амінакісьлевыя пасьлядоўнасьці розных формаў манамэраў стрэптавідзіна. Тоўстым выдзелена ядро (анг. core) стрэптавідзіна

Ген стрэптавідзіна кадуе поліпептыдны ланцуг, які складаецца з 159 амінакіслотных рэштак. Аднак, поўнапамерныя малекулы рэдка сустракаюцца ў КВ бактэрыяў-прадуцэнтаў, бо бялок падвяргаецца посттрансьляцыйнаму працэсінгу, а менавіта частковаму пратэолізу кожнае з чатырох субадзінак з N- і С-канцоў малекулы. У выніку ў прыродных прэпаратах стрэптавідзін уяўляе сабою часьцей за ўсё гетэрагенны прадукт зь нясталай малекулярнай масай [101][12]. Калі пратэоліз ідзе да канца, тады фарміруецца цалкам сьпелы "кор" стрэптавідзіна (анг. full mature core streptavidin). Акрамя таго, была атрымана яшчэ больш скарочаная рэкамбінантная форма стрэптавідзіна (уласна кор), якая захоўвае біяцінзьвязваючыя ўласьцівасьці (гл. малюнак справа).

Кожны манамэр прыроднага скарочанага стрэптавідзіна з малекулярнай масай 13273 кДа складаецца з 127 амінакіслотных рэштак. Коравы тэтрамэр (53 кда) валодае значна большай растваральнасьцю ў параўнаньні з поўнапамерным бялком і зьяўляецца асноўнай функцыянальнай формай стрэптавідзіна [102][13]. Поўнапамерныя тэтрамэры схільныя да агрэгацыі [101][12], пры гэтым міжмалекулярныя ўзаемадзеяньні, якія прыводзяць да алігамэрызацыі, апасродкуюцца канцавымі пасьлядоўнасьцямі. Варта адзначыць, што ў складзе коравага стрэптавідзіна адсутнічаюць амінакіслотныя рэшткі цысьцеіл і меціяніл, якія ўтрымліваюць серу (гл. табліцу).

 

Экспэрымэнтальна ўсталявана, што пратэялітычнае расшчапленьне канцавых пасьлядоўнасьцяў стрэптавідзіна можа ажыцьцяўляць шэраг пратэаз (пратэіназа К, папаін, пратэаза з Streptomyces griseus, субцілізін, тэрмалізін і эластаза). Трыпсін таксама расшчапляе поўнапамерны стрэптавідзін, аднак пры гэтым атрымоўваюцца формы з большай малекулярнай масай, чым коравая. Паколькі на С- і N-канцавых участках стрэптавідзіна адсутначаюць араматычныя амінакіслоты (гл. малюнак), хіматрыпсін і пепсін не аказваюць пратэялітычнага дзеяньня [101][12]. Для фармаваньня структуры стрэптавідзіна, здольнага да высокоафіннага зьвязваньня з біяцінам, асабліва важна расшчапленьне С-канцавой пасьлядоўнасьці. Паводле крышталеграфічнае структуры (малюнак 1.2в), дваццаць С-тэрмінальных амінакіслотных рэштак у поўнапамернай форме стрэптавідзіна фармуюць завесы на паверхні тэтрамэра [103][14] каля біяцінзьвязваючых сайтаў і замінаюць злучэньню зь лігандам. З N-канца амінакіслотныя рэшткі 150-153, якія ўваходзяць ў склад маючае адшчапіцца пасьлядоўнасьці, злучаюцца зь біяцінзьвязваючым сайтам, канкуруючы зь біяцініліравннымі аб’ектамі за гэта месца злучэньня. Гэта зьвязваньне слабое, аднак N-тэрмінальная пасьлядоўнасьць валодае структурнай гнуткасьцю, што дазваляе злучацца зь біяцінзьвязваючым сайтам малым па памеры лігандам, такім, як біяцін, у той час як для буйных біяцініліраваных малекул узьнікаюць стэрычныя абмежаваньні.

Структура біяцінзьвязваючага цэнтру

рэдагаваць

Комплекс стрэптавідзін-біяцін уяўляе сабою вельмі цікавы аб’ект для аналізу структурных фактараў, якія забясьпечваюць высокаафіннае ліганд-бялковае злучэньне. Вызначэньне прасторавай будовы поўнапамернага і коравага стрэптавідзіна і іх комплексаў зь лігандам мэтадам рэнтгенаструктурнага аналізу дазволіла ўсталяваць асаблівасьці міжмалекулярных узаемадзеяньняў. Прыродны коравы гоматэтрамэр стрэптавідзіна мае памеры 54×58×48 А, характарызуецца двухграннай D2-малекулярнай сімэтрыяй і нагадвае па форме пясочны гадзіньнік (малюнак 1.2б). Кожны манамэр стрэптавідзіна мае антыпаралельную {beta}-складкавую структуру, якая складаецца з васьмі сыходных і ўзыходных сумежных лінейных атос, што злучаюцца завесамі (малюнак 1.2а). Атосы разьмешчаны такім чынам, што першы і апошні {beta}-атосы суседнічаюць адзін з адным і злучаны вадароднымі сувязямі. Згорнуты антыпаралельны складкавы {beta}-ліст дадаткова скручаны і фармуе праваскручанную сьпіралепадобную цыліндрападобную структуру (малюнак 1.2а). Прастора паміж дымэрамі ("стан пясочнага гадзіньніка") вельмі шырокая і фармуецца ўсімі поліпептыднымі ланцугамі (малюнак 1.2б).

 
Будова стрэптавідзіна. а. Асобна паказаны скарочаны манамэр у комплексе з біяцінам. б. «Кор» прыроднага тэтрамэра, у якім субадзінкі пранумераваныя згодна [104][15]. в. Поўнапамерны стрэптавідзін. Цёмна-сінім паказаныя С- і N-канцы.

Сайт злучэньня біяціна знаходзіцца ў адкрытым канцы скручанага "ў скрутак" {beta}-ліста, дзе некалькі араматычных і палярных амінакіслот удзельнічаюць у стварэньні кішэні, якая адпавядае прасторавай структуры біяціна (малюнак 1.2а).

 
а. Біяцін. б. Даўжыні вадародных злучэньняў, якія ўтвараюцца паміж асобнымі атамамі біяціна і стрэптавідзіна ў біяцінзьвязваючым цэнтры

Малекула біяціна, прыроднага ліганда стрэптавідзіна, утрымоўвае біцыкл, які складаецца з карбаміднага і тэтрагідрафуранавага кольцаў, і рэшткі валер’янавай кіслаты (малюнак 1.3а). Частковы зарад маюць толькі атамы азоту і серы, якія ўваходзяць у склад гетэрацыкла, а таксама кіслародныя атамы карбаміднае і карбаксільнае груп біяціна. Яны бяруць удзел у стварэньні васьмі вадародных злучэньняў паміж біяцінам і бакавымі ланцугамі амінакіслотных рэштак у актыўным цэнтры стрэптавідзіна (малюнак 1.4б). Біяцін апускаецца досыць глыбока ў актыўны цэнтар стрэптавідзіна, так, што вонкі выступаюць толькі адзін з азотаў гетэрацыкла і абодва кісларода карбаксільнае групы [105][16]. Asn23, Ser27, Tyr43 утвораюць вадародныя сувязі c карбамідным атамам кіслароду, Asp128 — з N1-атамам карбаміднага кальца, а Ser45 — c N2-атамам гэтага ж кальца. Карбаксільная група біяціна ўдзельнічае ў стварэньні дзьвюх вадародных сувязяў — з Asn49 і Ser88, атам серы — з Thr90, а пентанаільная група дзякуючы гідрафобным узаемадзеяньням злучаецца з Trp120 [106][17]. Усе сувязі, якія ўтвараюцца, маюць даўжыню 2,63 — 3,37 А (малюнак 1.3б). Ва ўтварэньні біяцінзьвязваючага сайту бяруць удзел таксама араматычныя амінакіслоты Tyr43, Trp79, Trp92, Trp108 і Trp120, якія фарміруюць "гідрафобную скрынку" [104][15], прычым Trp120 належыць прылегламу манамэру малекулы стрэптавідзіна. Іншыя два Trp21 і Trp75 ня ўдзельнічаюць у злучэньні ліганда (малюнак 1.4а).

Аднак гідрафобныя і гідрафільныя ўзаемадзеяньні паміж біяцінам і стрэптавідзінам у поўнай меры не тлумачаць высокае падабенства бялку і ліганда. Знойдзена, што ў момант комплексаўтварэньня адбываюцца таксама зьмены другаснай, троеснай і чацьвярцічнай структураў стрэптавідзіна. Працэс злучэньня ўключае структурныя зьмены бялку, якія павялічваюць ступень камплемэнтарнасьці паміж унутранай паверхняй біяцінзьвязваючага сайту і лігандам, і суправаджаецца выцясьненьнем пяці малекул вады з актыўнага цэнтру. Пры гэтым адна зь петляў (анг. loop), так званая стрэптавідынавая зьвязваючая пятля, (рэшткі 45-52), разьмешчаная паміж трэцім і чацьвёртым атосамі антыпаралельнага складкавага {beta}-ліста манамэраў стрэптавідзіна [107][18], загінаецца над зьвязваючым сайтам і замыкае ў ім біяцін. Зьвязваючая пятля можа быць у дзьвюх розных канфармацыях — адкрытай і зачыненай. У агульным выпадку, зачыненая канфармацыя прымаецца ў выпадку наяўнасьці біяціна ў зьвязваючым сайце. Пры яго адсутнасьці зьвязваючая пятля знаходзіцца ў неспарадкаваным стане. Такім чынам, канфармацыя пятлі ўвесь час зьмяняецца, і яе нельга ўсталяваць мэтадам радыёграфіі ў крышталях. Адзначым, што некаторыя дасьледчыкі лічаць, што адкрытая ці зачыненая канфармацыя стрэптавідзінавае зьвязваючае пятлі не залежыць ад наяўнасьці ў біяцінзьвязваючым цэнтры біяціна [107][18]. Акрамя вышэйапісаных зьменаў стрэптавідзінавай зьвязваючай пятлі, малекула бялку ў цэлым становіцца больш кампактнай, што пацьвярджаецца зьніжэньнем хуткасьці абмену цяжкага і лёгкага вадароду паміж стрэптавідзінам і растваральнікам [108][19]. Тэтрамэр стрэптавідзіна можна разглядаць як "дымэр дымэраў" двух тыпаў: функцыянальных і структурных. Для ўтварэньня актыўнага біяцінзьвязваючага сайту важна функцыянальнае ўзаемадзеяньне паміж субадзінкамі 1 і 2 ці 3 і 4 (малюнак 1.2б). Галоўным пасроднікам гэтых узаемадзеяньняў выступае Trp120, які лакалізоўваецца ў пятле паміж сёмым і восьмым {beta}-атосамі. Ён фармуе частку актыўнага цэнтру суседняй субадзінкі, і наадварот. Таму дымэр, які складаецца з субадзінак 1 і 2 (3 і 4), зьяўляецца функцыянальным. Злучэньне з біяцінам прыводзіць да асацыяцыі штучна атрыманых манамэраў прыроднага кора стрэптавідзіна, прычым ключавую ролю ў самазборцы мае Trp120. Мутантавы стрэптавідзін, які мае замену Trp120 на Phe ці любую іншую амінакіслату, не фарміруе ды- і тэтрамэры ў прысутнасьці біяціна і характарызуецца зьніжаным падабенствам да ліганда (Ka~(1-3)?108 М-1) [92, 106][3][17]. Такім чынам, у стварэньні біяцінзьвязваючага сайту вельмі важнымі зьяўляюцца ўзаемадзеяньні паміж манамэрамі. Структурныя дымэры фарміруюцца паміж манамэрамі 1 і 4 (2 і 3) за кошт трох вадародных сувязяў. Паверхня кантакту, якая зьмяшчае толькі па тры амінакіслотных рэшткі субадзінак 1 і 3 (2 і 4), утвараюць разам з функцыянальнымі парамі манамэраў аб’яднаную дымэр-дымэрную паверхню. Нягледзячы на свой невялікі памер, паверхня паміж 1 і 3 (2 і 4) важная для стабільнасьці алігамэрнай формы стрэптавідзіна [108][19]. Замена некаторых амінакіслотных рэштак, якія лакалізуюцца на паверхні бялковай малекулы і не прымаюць непасрэднага ўдзелу ў зьвязваньні біяціна, прыводзіць да значнага зьніжэньня функцыянальнай актыўнасьці стрэптавідзіна. Да іх належаць, напрыклад, важныя амінакіслотныя рэшткі, якія фарміруюць паверхню, якая кантактуе з трыма іншымі субадзінкамі — Ala65, зьмешчаны ў завесе паміж 4 і 5 атосамі, Leu124 і Val125. Акрамя таго, замена Trp21, Trp75, His87, Asn85, Lys80, Arg84, гэта значыць рэштак, што не прымаюць удзел у фармавіраваньні актыўнага цэнтру, прыводзіць да поўнай ці істотнай страты здольнасьці злучаць вітамін Н. У той жа час, замена некаторых амінакіслотаў, якія ўтвараюць вадародныя сувязі з біяцінам, напрыклад, Ser27Ala, Tyr43Phe, Ser45Ala, не зьяўляецца крытычнай для праявы біяцінзьвязваючай актыўнасьці [94][5]. Thr114 і Leu124 цікавыя зь іншых пазыцыяў. Яны разьмешчаны ў вельмі абмежаванай прасторы на паверхні бялку. Таму іх замена на амінакіслоты з больш аб’ёмнымі бакавымі радыкаламі замінае правільнаму фолдынгу стрэптавідзіна [94][5]. І, наадварот, замена на амінакіслоты зь меншым бакавым радыкалам (Ala, Gly) прыводзіць да павелічэньня біяцінзьвязваючай актыўнасьці ў параўнаньні зь дзікім тыпам. Цікава, што стрэптавідзін здольны злучаць ня толькі біяцін і яго вытворныя, але і пептыды, якія зьмяшчаюць матыў His-Pro-Gln [108][19]. Гэта ўласьцівасьць з посьпехам была скарыстаная ва ўдасканаленым фагавым дысплеі [109][20]. Акрамя таго, стрэптавідзін з Kd парадку 10-4 M злучае канкуруючы з біяцінам фарбавальнік 2-(4-гідроксіазабензол)бензойную кіслату (2-(4-hydroxyazobenzoic acid, HABA), адначасова абескаляроўваючы яго. Пры выцясьненьні біяцінам ці яго вытворнымі дадзены фарбавальнік ізноў афарбоўваецца ў ярка-памяранцавы колер. Гэта ўласьцівасьць шырока выкарыстоўваецца ў шматлікіх канструкцыях для вызначэньня колькасных характарыстак злучэньня.

Фізыка-хімічныя ўласьцівасьці стрэптавідзіну

рэдагаваць

Растваральнасьць і стабільнасьць

рэдагаваць

Растваральнасьць стрэптавідзіна ў вадзе залежыць ад наяўнасьці ў яго структуры амінакіслотных рэштак да 21 і пасьля 130 палажэньняў. Поўнапамерная форма, якая складаецца з амінакіслотных рэштак 1-159, дрэнна растваральная ў вадзе [90][1], тады як водны раствор штучнага фрагмэнта, што ўключае амінакіслотныя рэшткі 21-130, можна сканцэнтраваць нават да 110 г/л (2,1 мм) [102][13]. Прыродны коравы стрэптавідзін (рэшткі 13-139) і іншыя формы з даўжэйшымі поліпептыднымі ланцугамі маюць прамежкавую растваральнасьць [110][21]. Малекула стрэптавідзіна характарызуецца высокай стабільнасьцю. Бялок не дэнатуруе ў 6 М мачавіне і вельмі павольна дэнатуруецца пад ўзьдзеяньнем 6 М гуанідзін-гідрахларыда (guanidine hydrochloride). Стрэптавідзін зьяўляецца значна больш устойлівым да шматлікіх дэнатуруючых узьдзеяньняў, чым большасьць іншых бялкоў, уключаючы авідын. Толькі такі моцны денатурант, як 6 М гуанідзін ціацыянат (Guanidinium thiocyanate), выклікае незваротную дэнатурацыю стрэптавідзіна (1,3 М — пасьля 5 дзён, 1 М — 39 дзён інкубацыі). Адсутнасьць у складзе стрэптавідзіна рэштак цыстэіна прадухіляе ўтварэньне папярочных сшывак, якія могуць зьменшыць верагоднасьць рэфолдзінгу. Тым ня менш, пасьля кантакту з гуанідзін-ціацыянатам аднаўляецца толькі дзьве траціны зыходнае біяцінзьвязваючае здольнасьці стрэптавідзіна. Комплекс стрэптавідзіна з біяцінам значна больш устойлівы ў адносінах да тэмпэратурнай дэнатурацыі, чым вольны стрэптавідзін, прычым стабільнасьць прама прапарцыйна залежыць ад ступені насычанасьці біяцінзьвязваючых цэнтраў (табліца 1.3, малюнак 1.5). Біяцінзьвязваючая актыўнасьць захоўваецца ў прысутнасьці ДДС-Na (нават пры 60С), а таксама ў растворы 6 М мачавіны. Бялок устойлівы да награваньня, дзеяньню высокіх і нізкіх значэньняў рН і шматлікіх пратэялітычных фэрмэнтаў [111][22].

Асабістая флуарэсцэнцыя стрэптавідзіна

рэдагаваць

Кожны манамэр стрэптавідзіна мае ў сваім складзе шэсьць трыптафанаў, таму бялок характарызуецца высокім каэфіцыентам экстынкцыі Е280 нм, 1 г/л = 3,4 [112][23]. Па чатыры рэшткі трыптафану знаходзіцца ў біяцінзьвязваючых цэнтрах. Злучэньне біяціна прыводзіць да значных зьмен у трыптафанавае флуарэсцэнцыі стрэптавідзіна. Пры гэтым адбываецца зрух максімуму ў караткахвалевую вобласьць і памяншаецца інтэнсіўнасьць флуарэсцэнцыі. Пры поўным насычэньні ўсіх біяцінзьвязваючых цэнтраў зрух роўны 5 нм, а інтэнсіўнасьць флуарэсцэнцыі зьмяншаецца на 25% [113][24]. Зьмены флюарэсцэнтных уласьцівасьцяў галоўным чынам выкліканы канфармацыйнымі зьменамі бялку. Зрух максімуму эмісіі ў караткахвалевую вобласьць пры злучэньні біяціна абумоўлены зьменамі мікраасяродзьдзя трыптафанілаў з-за павелічэньня кампактнасьці макрамалекулы, а зьніжэньне інтэнсіўнасьці флуарэсцэнцыі — экранаваньнем біяцінам рэштак трыптафану актыўнага цэнтру. Усталявана, што асноўны ўнёсак у агульную інтэнсіўнасьць эмісіі стрэптавідзіна пры эксьцітэнцыі сьвятлом з даўжынёй хвалі 295 нм уносяць трыптафаны зьвязваючых сайтаў кожнага манамэра. Гэта пацьвярджаюць вынікі экспэрымэнтаў па тушэньні трыптафанавае флуарэсцэнцыі стрэптавідзіна нэўтральным тушыльгікам акрыламідам. У вольным стрэптавідзіне адбываецца тушэньне флуарэсцэнцыі без зруху максімуму эмісіі, што паказвае на аднолькавую даступнасьць усіх трыптафанаў для тушыльніка. Пры тытраваньні акрыламідам насычанага комплексу стрэптавідзін-біяцін уласная флуарэсцэнцыя бялку тушыцца зусім трошкі. Больш высокія значэньні ўяўных канстант дынамічнага тушэньня Штэрна-Фольмера Кsv(уяў.) і статычнага тушэньня V(уяў.) [113][24] былі разьлічаны для вольнага стрэптавідзіна ў параўнаньні са стрэптавідзінам, насычаным біяцінам (табліца 1.4). Канфармацыйная прырода зьмен, якія адбываюцца ў малекуле стрэптавідзіна пасьля стварэньня комплексу з біяцінам пацьвярджаецца таксама памяншэньнем амаль у два разу часу эмісіі сьвятла трыптафаніламі. У прысутнасьці акрыламіду час жыцьця флуарэсцэнцыі стрэптавідзіна памяншаецца на 30%, у той час як для стрэптавідзін-біяцінавага комплексу гэты парамэтар застаецца практычна нязьменным (табліца 1.4).

Электрафарэтычная рухавасьць

рэдагаваць

Тэтрамэрны стрэптавідзін, у адрозьненьне ад вольных субадзінак, дрэнна афарбоўваецца Кумасі дыямэнтавым блакітным (малюнак 1.5). Гэта зьвязана са значна больш высокай ступеньню кампактызацыі тэтрамэра [113, 114][24][25]. У літаратуры найболей ахарактарызавана электрафарэтычная рухомасьць прэпаратаў стрэптавідзіна (вольнага і ў комплексе з біяцінам) у ПААГ у прысутнасьці ДДС-Na і 6 М мачавіны. Прысутнасьць мачавіны ў растворы стрэптавідзіна выклікае некалькі эфэктаў. З аднаго боку, мачавіна ў высокіх канцэнтрацыях зьяўляецца моцным дэнатуруючым (хаатропным) агентам у стаўленьні да бялкоў, зь іншага боку, малекула мачавіны структурна роднасная карбаміднае групоўцы ў адным з цыклаў біяціна. У адсутнасьць ліганда мачавіна замяшчае малекулы вады, якія займаюць біяцінзьвязваючы цэнтар стрэптавідзіна з Кd у інтэрвале (3,6-12)?10-2 М, выклікаючы слабыя канфармацыйныя зьмены, якія стабілізуюць стрэптавідзін. Таму ў адрозьненьне ад большасьці бялкоў, электрафарэтычная рухомасьць якіх прыкметна памяншаецца ў 6 М мачавіне, стрэптавідзін у асяродзьдзі гэтага хаатропнага агента захоўвае электрафарэтычныя ўласьцівасьці, характэрныя для натыўных умоваў [113, 114][24][25]. Біяцін выцясьняе слаба злучаную мачавіну, ініцыюючы значна глыбейшыя канфармацыйныя зьмены, якія робяць малекулу стрэптавідзіна больш элептычнай і кампактнай і абумаўляюць высокі стабілізуючы эфэкт. Акрамя таго, біяцін зьяўляецца арганічнай кіслатой (pI~3,5), і яго злучэньне зьмяняе агульны зарад стрэптавідзіна на больш адмоўны. Вынікам апісанага вышэй спалучэньня ўзьдзеяньняў зьяўляецца павелічэньне рухомасьці комплексу біяцін-стрэптавідзін у параўнаньні з вольным стрэптавідзінам падчас электрафарэзу ў ПААГ у прысутнасьці 6 М мачавіны (малюнак 1.6).

Супярэчлівыя вынікі прыведзены ў літаратуры адносна ўплыва зьвязваньня стрэптавідзінам біяціна на рухомасьць комплекса ў ПААГ у адсутнасьці мачавіны [113 114 115][24][25][26].

Мэтады выдзяленьня стрэптавідзіну

рэдагаваць

Ачыстка стрэптавідзіна, сынтэзаванага ў клеткавай культуры, зьяўляецца ключавым этапам тэхналёгіі атрыманьня бялку, прызначанага для імабілізацыі на цьвёрдае фазе ці кан’югіраваньня зь фэрмэнтамі. Апісана мноства спосабаў выдзяленьня стрэптавідзіна з культуральнае вадкасьці S. avidinii ці клеткавых сыстэм экспрэсіі рэкамбінантнага бялку, заснаваных на традыцыйных методыках бялковай хіміі [116 117 118][27][28][29] ці афіннай храматаграфіі [119 120 121 122][30][31][32][33]. Стварэньне высокаэфэктыўных штамаў-прадуцэнтаў рэкамбінантнага стрэптавідзіна [100, 122 123 124][11][33][34][35] і яго біяцінзьвязваючых фрагмэнтаў [125][36] істотна спрасьціла працэдуру атрыманьня актыўных прэпаратаў. Аднак, нягледзячы на посьпехі ў атрыманьні рэкамбінантных аналогаў, прыродны стрэптавідзін у наш час шырока выкарыстоўваецца, напрыклад, у вытворчасьці сучасных дыягнастычных сродкаў. Большасьць апісаных у літаратуры спосабаў выдзяленьня чыстага стрэптавідзіна з КВ заснаваныя на храматаграфіях — афіннай [126][37], аніёнаабменнай [116][27] і гідрафобнай [117][28]. Распрацаваныя і нехраматаграфічныя мэтады выдзяленьня, якія ўключаюць у якасьці галоўных стадыяў селектыўную сорбцыю бялкоў на оксіапатыце і іншых фасфатах кальцыя [127][38], а таксама тартраце кальцыя [128][39], ужываньне тэрмаўляганьня полі-N-ізапрапілакрыламіда, мадыфікаванага па канцавых N-амінагрупам 2-імінабіяціна [129-130][40][41]. Добрыя вынікі дае і неспэцыфічнае ўляганьне сульфатам амонія пры ўмове, што акцінаміцэты выгадоўваліся ў сынтэтычным асяродзьдзі [118][29]. На першым этапе атрыманьня стрэптавідзіна рэкамэндуюць улічваць той факт, што пры старэньні культуры назіраецца зьмена мэханізмаў посттрансьляцыйнай мадыфікацыі бялку; гэта чыніць парушэньні пратэоліза стрэптавідзіна і прыводзіць да стварэньня вялікамалекулярных агрэгатаў [101][12], што значна зьмяншае выйсьце актыўнага прадукта. У лябараторнай практыцы найбольш часта ўжываецца афінная слупковая храматаграфія на сарбентах з імабілізаванымі вытворнымі біяціна [119, 131][30][42]. У якасьці афіннага ліганда часьцей за ўсё выкарыстоўваюць імінабіяцін, падабенства якога да стрэптавідзіна крытычна залежыць ад рН асяродзьдзя. Пры рН 11 Кd мае парадак 10-8 М, у той час як пры рн 4,0 імінабіяцін цалкам губляе падабенства да стрэптавідзіна. Гэта зьвязана са зьяўленьнем зарада ў гуанідынавае групы імінабіяціна ў кіслых умовах (малюнак 1.7).

Крыніцы

рэдагаваць
  1. ^ а б Green, N.M. Avidin and streptavidin / N.M. Green // Methods Enzymol. - 1990. - Vol. 184, № - P. 51-67.
  2. ^ Tausig, F. Streptavidin--a substance with avidin-like properties produced by microorganisms / F. Tausig, F.J. Wolf // Biochem Biophys Res Commun. - 1964. - Vol. 14, № - P. 205-209.
  3. ^ а б в Bayer, E. A., Kulik, T., Adar, R., and Wilchek, M. (1995) Close similarity among streptavidin-like, biotin-binding proteins from Streptomyces, Biochim Biophys Acta 1263, 60-66.
  4. ^ Argarana, C. E., Kuntz, I. D., Birken, S., Axel, R., and Cantor, C. R. (1986) Molecular cloning and nucleotide sequence of the streptavidin gene, Nucleic Acids Res 14, 1871-1882.
  5. ^ а б в Laitinen, O. H., Hytonen, V. P., Nordlund, H. R., and Kulomaa, M. S. (2006) Genetically engineered avidins and streptavidins, Cell Mol Life Sci 63, 2992-3017.
  6. ^ Sano, T., and Cantor, C. R. (1990) Expression of a cloned streptavidin gene in Escherichia coli, Proc Natl Acad Sci U S A 87, 142-146.
  7. ^ Voss, S., and Skerra, A. (1997) Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification, Protein Eng 10, 975-982.
  8. ^ Laitinen, O. H., Airenne, K. J., Marttila, A. T., Kulik, T., Porkka, E., Bayer, E. A., Wilchek, M., and Kulomaa, M. S. (1999) Mutation of a critical tryptophan to lysine in avidin or streptavidin may explain why sea urchin fibropellin adopts an avidin-like domain, FEBS Lett 461, 52-58.
  9. ^ Markwick, N. P., Docherty, L. C., Phung, M. M., Lester, M. T., Murray, C., Yao, J. L., Mitra, D. S., Cohen, D., Beuning, L. L., Kutty-Amma, S., and Christeller, J. T. (2003) Transgenic tobacco and apple plants expressing biotin-binding proteins are resistant to two cosmopolitan insect pests, potato tuber moth and lightbrown apple moth, respectively, Transgenic Res 12, 671-681.
  10. ^ Wu, S. C., and Wong, S. L. (2006) Intracellular production of a soluble and functional monomeric streptavidin in Escherichia coli and its application for affinity purification of biotinylated proteins, Protein Expr Purif 46, 268-273.
  11. ^ а б Nagarajan, V., Ramaley, R., Albertson, H., and Chen, M. (1993) Secretion of streptavidin from Bacillus subtilis, Appl Environ Microbiol 59, 3894-3898.
  12. ^ а б в г Bayer, E. A., Ben-Hur, H., Hiller, Y., and Wilchek, M. (1989) Postsecretory modifications of streptavidin, Biochem J 259, 369-376.
  13. ^ а б Pahler, A., Hendrickson, W. A., Kolks, M. A., Argarana, C. E., and Cantor, C. R. (1987) Characterization and crystallization of core streptavidin, J Biol Chem 262, 13933-13937.
  14. ^ Le Trong, I., Humbert, N., Ward, T. R., and Stenkamp, R. E. (2006) Crystallographic analysis of a full-length streptavidin with its C-terminal polypeptide bound in the biotin binding site, J Mol Biol 356, 738-745.
  15. ^ а б Livnah, O., Bayer, E. A., Wilchek, M., and Sussman, J. L. (1993) Three-dimensional structures of avidin and the avidin-biotin complex, Proc Natl Acad Sci U S A 90, 5076-5080.
  16. ^ Hendrickson, W. A., Pahler, A., Smith, J. L., Satow, Y., Merritt, E. A., and Phizackerley, R. P. (1989) Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation, Proc Natl Acad Sci U S A 86, 2190-2194.
  17. ^ а б Sano, T., and Cantor, C. R. (1995) Intersubunit contacts made by tryptophan 120 with biotin are essential for both strong biotin binding and biotin-induced tighter subunit association of streptavidin, Proc Natl Acad Sci U S A 92, 3180-3184.
  18. ^ а б Freitag, S., Le Trong, I., Klumb, L., Stayton, P. S., and Stenkamp, R. E. (1997) Structural studies of the streptavidin binding loop, Protein Sci 6, 1157-1166.
  19. ^ а б в Williams, D. H., Stephens, E., and Zhou, M. (2003) Ligand binding energy and catalytic efficiency from improved packing within receptors and enzymes, J Mol Biol 329, 389-399.
  20. ^ Meyer, S. C., Gaj, T., and Ghosh, I. (2006) Highly selective cyclic peptide ligands for NeutrAvidin and avidin identified by phage display, Chem Biol Drug Des 68, 3-10.
  21. ^ Sano, T., Pandori, M. W., Chen, X., Smith, C. L., and Cantor, C. R. (1995) Recombinant core streptavidins. A minimum-sized core streptavidin has enhanced structural stability and higher accessibility to biotinylated macromolecules, J Biol Chem 270, 28204-28209.
  22. ^ Laitinen, O. H., Nordlund, H. R., Hytonen, V. P., and Kulomaa, M. S. (2007) Brave new (strept)avidins in biotechnology, Trends Biotechnol 25, 269-277.
  23. ^ Bayer, E. A., and Wilchek, M. (1990) Application of avidin-biotin technology to affinity-based separations, J Chromatogr 510, 3-11.
  24. ^ а б в г д Gonzalez, M., Bagatolli, L. A., Echabe, I., Arrondo, J. L., Argarana, C. E., Cantor, C. R., and Fidelio, G. D. (1997) Interaction of biotin with streptavidin. Thermostability and conformational changes upon binding, J Biol Chem 272, 11288-11294.
  25. ^ а б в Sano, T., and Cantor, C. R. (1990) Cooperative biotin binding by streptavidin. Electrophoretic behavior and subunit association of streptavidin in the presence of 6 M urea, J Biol Chem 265, 3369-3373.
  26. ^ Jones, M. L., and Kurzban, G. P. (1995) Noncooperativity of biotin binding to tetrameric streptavidin, Biochemistry 34, 11750-11756.
  27. ^ а б Jia, W., Huang, J., and Meng, W. (1995) [Identification of streptavidin], Hua Xi Yi Ke Da Xue Xue Bao 26, 436-438.
  28. ^ а б Suter, M., Cazin, J., Jr., Butler, J. E., and Mock, D. M. (1988) Isolation and characterization of highly purified streptavidin obtained in a two-step purification procedure from Streptomyces avidinii grown in a synthetic medium, J Immunol Methods 113, 83-91.
  29. ^ а б Bayer, E. A., Ben-Hur, H., Gitlin, G., and Wilchek, M. (1986) An improved method for the single-step purification of streptavidin, J Biochem Biophys Methods 13, 103-112.
  30. ^ а б Gallizia, A., de Lalla, C., Nardone, E., Santambrogio, P., Brandazza, A., Sidoli, A., and Arosio, P. (1998) Production of a soluble and functional recombinant streptavidin in Escherichia coli, Protein Expr Purif 14, 192-196.
  31. ^ Sorensen, H. P., Sperling-Petersen, H. U., and Mortensen, K. K. (2003) A favorable solubility partner for the recombinant expression of streptavidin, Protein Expr Purif 32, 252-259.
  32. ^ Avrantinis, S. K., Stafford, R. L., Tian, X., and Weiss, G. A. (2002) Dissecting the streptavidin-biotin interaction by phage-displayed shotgun scanning, Chembiochem 3, 1229-1234.
  33. ^ а б Zischler, H., Nanda, I., Schafer, R., Schmid, M., and Epplen, J. T. (1989) Digoxigenated oligonucleotide probes specific for simple repeats in DNA fingerprinting and hybridization in situ, Hum Genet 82, 227-233.
  34. ^ Schwidop, W. D., Klossek, P., Muller, R., and Claus, R. (1990) Procedure for the purification of streptavidin by hydrophobic interaction chromatography, J Chromatogr 520, 325-331.
  35. ^ Klein, C. P., de Groot, K., Vermeiden, J. P., and van Kamp, G. (1980) Interaction of some serum proteins with hydroxylapatite and other materials, J Biomed Mater Res 14, 705-712.
  36. ^ Akhrem, A. A., and Drozhdenyuk, A. P. (1989) Calcium tartrate gel, Anal Biochem 179, 86-89.
  37. ^ Freitag, R., and Hilbrig, F. (2007) Use of the avidin (imino)biotin system as a general approach to affinity precipitation, Methods Mol Biol 418, 35-50.
  38. ^ Garret-Flaudy, F., and Freitag, R. (2000) Use of the avidin (imino)biotin system as a general approach to affinity precipitation, Biotechnol Bioeng 71, 223-234.
  39. ^ Hirsch, J. D., Eslamizar, L., Filanoski, B. J., Malekzadeh, N., Haugland, R. P., Beechem, J. M., and Haugland, R. P. (2002) Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation, Anal Biochem 308, 343-357.
  40. ^ Nordlund, H. R., Hytonen, V. P., Laitinen, O. H., and Kulomaa, M. S. (2005) Novel avidin-like protein from a root nodule symbiotic bacterium, Bradyrhizobium japonicum, J Biol Chem 280, 13250-13255.
  41. ^ Helppolainen, S. H., Nurminen, K. P., Maatta, J. A., Halling, K. K., Slotte, J. P., Huhtala, T., Liimatainen, T., Yla-Herttuala, S., Airenne, K. J., Narvanen, A., Janis, J., Vainiotalo, P., Valjakka, J., Kulomaa, M. S., and Nordlund, H. R. (2007) Rhizavidin from Rhizobium etli: the first natural dimer in the avidin protein family, Biochem J 405, 397-405.
  42. ^ Hytonen, V. P., Laitinen, O. H., Grapputo, A., Kettunen, A., Savolainen, J., Kalkkinen, N., Marttila, A. T., Nordlund, H. R., Nyholm, T. K., Paganelli, G., and Kulomaa, M. S. (2003) Characterization of poultry egg-white avidins and their potential as a tool in pretargeting cancer treatment, Biochem J 372, 219-225.
Атрымана з «https://be-tarask.wikipedia.org/w/index.php?title=Стрэптавідын&oldid=2485111»