Стрэптавідын: розьніца паміж вэрсіямі

'''Стрэптавідзін''' (ад анг. streptavidin; strept- "які належыць да стрэпта", "авіднасьць, ") - [[Бялкі|бялок]] бактэрыяльнага паходжаньня, негліказіліраваны гоматэтрамер з [[Адносная малекулярная маса|малекулярнай масай]] 56-70 кДа, які мае высокую афіннасьць да [[Вітаміны|вітаміна]] Н ([[Біяцін|біяціну]]) (Кd=5,5x10-13 М). Дзякуючы наяўнасцінаяўнасьці ў кожнай субадзінцы па адным біятынзвязваючымбіятынзьвязваючым цэнтры, стрэптавідзін шырока выкарыстоўваецца ў якасціякасьці пасродніка пры злучэннізлучэньні дзвюхдзьвюх ці некалькіх кан'югаваных з [[Біяцін|біяцінам]] аб'ектаў ([[Бялкі|бялкі]], [[Нуклійныя кісьлі|нуклеінавыя кіслоты]], [[Вуза|вузы]]і і інш.).

Прыроднымі прадуцэнтамі стрэптавідзінаў з'яўляюццазьяўляюцца [[Акцінаміцэты|акцінаміцэты]] [[Род (біялёгія)|роду]] Streptomyces [[Сямейства (біялёгія)|сямейства]] Streptomycetaceae [[Атрад (біялёгія)|парадку]] Actinomycetales [90]<ref>Green, N.M. Avidin and streptavidin / N.M. Green // Methods Enzymol. - 1990. - Vol. 184, № - P. 51-67.</ref>. Уласна стрэптавідзін як [[Бялкі|бялок]], які з'яўляеццазьяўляецца часткай унікальнага сінэргічнага антыбіятычнага комплексу, быў упершыню вылучаны з культуральнай вадкасцівадкасьці (КВ) віда S. avidinii у [[1964]] г. [91]<ref>Tausig, F. Streptavidin--a substance with avidin-like properties produced by microorganisms / F. Tausig, F.J. Wolf // Biochem Biophys Res Commun. - 1964. - Vol. 14, № - P. 205-209.</ref>. Нашмат пазнейпазьней, у [[1985]] г., падобная актыўнасцьактыўнасьць была знойдзена яшчэ ў аднаго віду - S. venezuelae, пры гэтым [[Біяцінзьвязваючыя бялкі|біяцінзьвязваючыя бялкі]] ў складзе антыбіятычнага комплексу, падобныя на стрэптавідзін з S. avidinii, прадукавалі толькі штамы Tu 2460 і Tu 2605. Адпаведныя [[Бялкі|бялкі]] былі названыя стрэптавідзін v.1 і стрэптавідзін v.2. Іх першасныя паслядоўнасціпасьлядоўнасьці маюць высокую ступень гамалогіігамалёгіі са стрэптавідзінам, прычым захоўваюцца ўсе кансерватыўныякансэрватыўныя [[Амінакісьлі|амінакіслотныя рэшткі]], неабходныя для функцыянальнай актыўнасціактыўнасьці [92]<ref>Bayer, E. A., Kulik, T., Adar, R., and Wilchek, M. (1995) Close similarity among streptavidin-like, biotin-binding proteins from Streptomyces, Biochim Biophys Acta 1263, 60-66.</ref>.

БіясінтэзБіясынтэз стрэптавідзіна не зьяўляецца таксанамічнай прыкметай. Па-першае, не ва ўсіх [[Штам|штамаў]] аднаго віда S. venezuelae прысутнічае здольнасцьздольнасьць сінтэзавацьсынтэзаваць стрэптавідзін. Па-другое, у S. lavendulae, віда значна бліжэйшага да S. avidinii, таксама адсутнічае сінтэзсынтэз якога-небудзь [[Біяцінзьвязваючыя бялкі|біяцінзьвязваючага бялка]] [92]<ref>Bayer, E. A., Kulik, T., Adar, R., and Wilchek, M. (1995) Close similarity among streptavidin-like, biotin-binding proteins from Streptomyces, Biochim Biophys Acta 1263, 60-66.</ref>.

Упершыню [[ген]], які кадуе поўнапамерную форму стрэптавідзіна, быў клянаваны і сіквеніраваны у [[1986]] годзе [93, 94]<ref>Argarana, C. E., Kuntz, I. D., Birken, S., Axel, R., and Cantor, C. R. (1986) Molecular cloning and nucleotide sequence of the streptavidin gene, Nucleic Acids Res 14, 1871-1882.</ref> <ref>Laitinen, O. H., Hytonen, V. P., Nordlund, H. R., and Kulomaa, M. S. (2006) Genetically engineered avidins and streptavidins, Cell Mol Life Sci 63, 2992-3017.</ref>. З таго часу былі распрацаваныя разнастайныя [[Сістэма экспрэсіі|сістэмысыстэмы для экспрэсіі]] стрэптавідзіна. ЧасцейЧасьцей за ўсё для атрыманьня рэкамбінантнага стрэптавідзіна выкарыстоўвалі [[бактэрыі]], асабліва [[Escherichia coli]]. ВыкарыстаннеВыкарыстаньне цытаплазматычнаецытаплязматычнае [[Сістэма экспрэсіі|экспресійнае сістэмысыстэмы]] (Т7 РНК-палімераза/Т7 прамотар) E. coli прыводзіць галоўным чынам да назапашванняназапашваньня нерастваральнага стрэптавідзіна ў цялятах уключэнняуключэньня, што патрабуе дадатковых стадыяў рэнатурацыі і ўскладняе далейшае вылучэнневылучэньне актыўнага [[Бялкі|бялку]] [95]<ref>Sano, T., and Cantor, C. R. (1990) Expression of a cloned streptavidin gene in Escherichia coli, Proc Natl Acad Sci U S A 87, 142-146.</ref>. Растваральную форму [[Бялкі|бялку]] атрымлівалі з дапамогай хімерных генетычных канструкцыяў, якія зьмяшчаюць сігнальнысыгнальны пептыд OmpA у клетках E. coli [96]<ref>Voss, S., and Skerra, A. (1997) Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification, Protein Eng 10, 975-982.</ref>, а таксама ў гетэралагічныхгетэралягічных сістэмахсыстэмах экспрэсіі на аснове [[Вуза|вузаў]] [[Вусякі|вусякі]] Spodoptera frugiperda [97]<ref>Laitinen, O. H., Airenne, K. J., Marttila, A. T., Kulik, T., Porkka, E., Bayer, E. A., Wilchek, M., and Kulomaa, M. S. (1999) Mutation of a critical tryptophan to lysine in avidin or streptavidin may explain why sea urchin fibropellin adopts an avidin-like domain, FEBS Lett 461, 52-58.</ref>, тытуню і яблыні [98]<ref>Markwick, N. P., Docherty, L. C., Phung, M. M., Lester, M. T., Murray, C., Yao, J. L., Mitra, D. S., Cohen, D., Beuning, L. L., Kutty-Amma, S., and Christeller, J. T. (2003) Transgenic tobacco and apple plants expressing biotin-binding proteins are resistant to two cosmopolitan insect pests, potato tuber moth and lightbrown apple moth, respectively, Transgenic Res 12, 671-681.</ref>. У адрозненьніадрозьненьні ад папярэдніх дасьледваньняў, дзе стрэптавідзін звычайна атрымлівалі ў форме "кора" (анг. "core"), быў таксама атрыманы растваральны поўнапамерны мутантавы стрэптавідзін у цытаплазмецытаплазьме E. coli [99]<ref>Wu, S. C., and Wong, S. L. (2006) Intracellular production of a soluble and functional monomeric streptavidin in Escherichia coli and its application for affinity purification of biotinylated proteins, Protein Expr Purif 46, 268-273.</ref>. Акрамя таго, для атрыманняатрыманьня растваральнага стрэптавідзіна распрацавана эфектыўнаяэфэктыўная экспресійная сістэмасыстэма ў Bacillus subtilis [100]<ref>Nagarajan, V., Ramaley, R., Albertson, H., and Chen, M. (1993) Secretion of streptavidin from Bacillus subtilis, Appl Environ Microbiol 59, 3894-3898.</ref>.

Па структурных і функцыянальных уласцівасцяхуласьцівасьцях стрэптавідзін адносяць да вялікага суперсемействусупэрсемейству каліцынаў. У яго ўваходзяць разнастайныя невялікія па памерах пазаклеткавыя [[Бялкі|бялкі]], якія зьвязваюць нізкамалекулярныя гідрафобныя ліганды. ДзвеДзьве спецыфічныяспэцыфічныя групы каліцынавае сям'і, ліпакаліны і авідзіны, маюць падобную {beta}-складкавую структуру, якая складаецца зь васьмі антыпаралельных ?-атосаў.

Бактэрыяльны бялок стрэптавідзін уяўляе сабою негліказіліраваны гомотетрамер, які сакрэтуецца глебавымі бактэрыямі S. avidinii (гл. вышэй). Кожны з манамераў здольны некавалентна зьвязваць па адной малекуле вітаміна Н ([[Біяцін|біяціну]]) з высокай афіннасьцю (Кd=5,5х10-13 М). [[Біяцін]], асноўны ліганд стрэптавідзіна, з'яўляеццазьяўляецца актыўным кампанентамкампанэнтам біяцыціну - прастэтычнай групы ферментаў, якія каталізуюць рэакцыі карбаксіліраваньня. Стрэптавідзін-біяцінавыя комплексы, дзякуючы сваёй высокай стабільнасцістабільнасьці, шырока выкарыстоўваюцца ў разнастайных біятэхналагічныхбіятэхналягічных працэсах і сістэмахсыстэмах.

[[File:Sikvens pounapamernaga i streptavidzina i jago koravae czastki.png|thumb|600px|Амінакіслотныя паслядоўнасьціпасьлядоўнасьці розных формаў манамераў стрэптавідзіна. Тоўстым выдзелены кор (анг. "core") стрэптавідзіна]]

[[Ген]] стрэптавідзіна кадуе поліпептыдны ланцуг, які складаецца з 159 амінакіслотных рэштак. Аднак, поўнапамерныя малекулы рэдка сустракаюцца ў КВ бактэрыяў-прадуцэнтаў, бо бялок падвяргаецца посттрансляцыйнамупосттрансьляцыйнаму працэсінгу, а менавіта частковаму пратэолізу кожнае з чатырох субадзінак з N- і С-канцоў малекулы. У выніку ў прыродных прэпаратах стрэптавідзін уяўляе сабою часцейчасьцей за ўсё гетэрагенны прадукт ззь нясталай малекулярнай масай [101]<ref>Bayer, E. A., Ben-Hur, H., Hiller, Y., and Wilchek, M. (1989) Postsecretory modifications of streptavidin, Biochem J 259, 369-376.</ref>. Калі пратэоліз ідзе да канца, тады фарміруецца цалкам спелысьпелы "кор" стрэптавідзіна (анг. "full mature core streptavidin"). Акрамя таго, была атрымана яшчэ больш скарочаная рэкамбінантная форма стрэптавідзіна (уласна кор), якая захоўвае біяцінзьвязваючыя ўласцівасціўласьцівасьці (гл. малюнак справа).

Кожны манамер прыроднага скарочанага стрэптавідзіна з малекулярнай масай 13273 кДа складаецца з 127 амінакіслотных рэштак. Коравы тэтрамер (53 кда) валодае значна большай растваральнасцюрастваральнасьцю ў параўнанніпараўнаньні з поўнапамерным [[Бялкі|бялком]] і з'яўляеццазьяўляецца асноўнай функцыянальнай формай стрэптавідзіна [102]<ref>Pahler, A., Hendrickson, W. A., Kolks, M. A., Argarana, C. E., and Cantor, C. R. (1987) Characterization and crystallization of core streptavidin, J Biol Chem 262, 13933-13937.</ref>. Поўнапамерныя тетрамеры схільныя да агрэгацыі [101]<ref>Bayer, E. A., Ben-Hur, H., Hiller, Y., and Wilchek, M. (1989) Postsecretory modifications of streptavidin, Biochem J 259, 369-376.</ref>, пры гэтым міжмалекулярныя ўзаемадзеянніўзаемадзеяньні, якія прыводзяць да алігамерызацыі, апасродкуюцца канцавымі паслядоўнасцяміпасьлядоўнасьцямі. Варта адзначыць, што ў складзе коравага стрэптавідзіна адсутнічаюць амінакіслотныя рэшткі цысцеілцысьцеіл і меціяніл, якія утрымліваюць серу (гл. табліцу).

ЭксперыментальнаЭкспэрымэнтальна ўсталявана, што пратэялітычнае расшчапленнерасшчапленьне канцавых паслядоўнасцяўпасьлядоўнасьцяў стрэптавідзіна можа ажыццяўляцьажыцьцяўляць шэраг пратэаз (пратэіназа К, папаін, пратэаза з Streptomyces griseus, субцілізін, тэрмалізін і эластаза). Трыпсін таксама расшчапляе поўнапамерны стрэптавідзін, аднак пры гэтым атрымоўваюцца формы з большай малекулярнай масай, чым коравая. Паколькі на С- і N-канцавых участках стрэптавідзіна адсутначаюць араматычныя амінакіслоты (гл. малюнак), хіматрыпсін і пепсін не аказваюць пратэялітычнага дзеяннядзеяньня [101]<ref>Bayer, E. A., Ben-Hur, H., Hiller, Y., and Wilchek, M. (1989) Postsecretory modifications of streptavidin, Biochem J 259, 369-376.</ref>.

Для фармаванняфармаваньня структуры стрэптавідзіна, здольнага да высокоафіннага зьвязваньня з [[Біяцін|біяцінам]], асабліва важна расшчапленнерасшчапленьне С-канцавой паслядоўнасціпасьлядоўнасьці. Паводле крышталеграфічнае структуры (малюнак 1.2в), дваццаць С-тэрмінальных амінакіслотных рэштак у поўнапамернай форме стрэптавідзіна фармуюць завесы на паверхні тетрамера [103]<ref>Le Trong, I., Humbert, N., Ward, T. R., and Stenkamp, R. E. (2006) Crystallographic analysis of a full-length streptavidin with its C-terminal polypeptide bound in the biotin binding site, J Mol Biol 356, 738-745.</ref> каля біяцінзьвязваючых сайтаў і замінаюць злучэннюзлучэньню ззь лігандам. З N-канца амінакіслотныя рэшткі 150-153, якія ўваходзяць ў склад маючае адшчапіцца паслядоўнасціпасьлядоўнасьці, злучаюцца ззь біяцінзьвязваючым сайтам, канкуруючы ззь біяцініліравннымі аб'ектамі за гэта месца злучэннязлучэньня. Гэта зьвязваньне слабое, аднак N-тэрмінальная паслядоўнасцьпасьлядоўнасьць валодае структурнай гнуткасцюгнуткасьцю, што дазваляе злучацца ззь біяцінзьвязваючым сайтам малым па памеры лігандам, такім, як [[Біяцін|біяцін]], у той час як для буйных біяцініліраваных малекул узнікаюцьузьнікаюць стэрычныя абмежаванніабмежаваньні.

Комплекс стрэптавідзін-[[Біяцін|біяцін]] уяўляе сабою вельмі цікавы аб'ект для аналізу структурных фактараў, якія забяспечваюцьзабясьпечваюць высокаафіннае ліганд-бялковае злучэннезлучэньне. ВызначэннеВызначэньне прасторавай будовы поўнапамернага і коравага стрэптавідзіна і іх комплексаў ззь лігандам метадаммэтадам рэнтгенаструктурнага аналізу дазволіла ўсталяваць асаблівасціасаблівасьці міжмалекулярных узаемадзеянняўузаемадзеяньняў.

Прыродны коравы гоматэтрамер стрэптавідзіна мае памеры 54х58х48 А, характарызуецца двухграннай D2-малекулярнай сіметрыяйсімэтрыяй і нагадвае па форме пясочны гадзіннікгадзіньнік (малюнак 1.2б). Кожны манамер стрэптавідзіна мае антыпаралельную {beta}-складкавую структуру, якая складаецца з васьмі сыходных і ўзыходных сумежных лінейных атос, што злучаюцца завесамі (малюнак 1.2а). Атосы размешчаныразьмешчаны такім чынам, што першы і апошні {beta}-атосы суседнічаюць адзін з адным і злучаны вадароднымі сувязямі. Згорнуты антыпаралельны складкавы {beta}-ліст дадаткова скручаны і фармуе праваскручанную спіралепадобнуюсьпіралепадобную цыліндрападобную структуру (малюнак 1.2а). Прастора паміж дымерамі ("стан пясочнага гадзіннікагадзіньніка") вельмі шырокая і фармуецца ўсімі поліпептыднымі ланцугамі (малюнак 1.2б).

Сайт злучэннязлучэньня [[Біяцін|біяціна]] знаходзіцца ў адкрытым канцы скручанага "ў скрутак" {beta}-ліста, дзе некалькі араматычных і палярных амінакіслот удзельнічаюць у стварэнністварэньні кішэні, якая адпавядае прасторавай структуры [[Біяцін|біяціна]] (малюнак 1.2а).

[[File:Bijacin-streptavidzin_dauzhynia zluczenniau.png|thumb|600px|а. [[Біяцін|Біяцін]]. б. Даўжыні вадародных злучэнняўзлучэньняў, якія ўтвараюцца паміж асобнымі атамамі [[Біяцін|біяціна]] і стрэптавідзіна ў біяцінзьвязваючым цэнтры]]

Малекула [[Біяцін|біяціна]], прыроднага ліганда стрэптавідзіна, утрымоўвае біцыкл, які складаецца з карбаміднага і тетрагідрафуранавага кольцаў, і рэшткі валер'янавай кіслаты (малюнак 1.3а). Частковы зарад маюць толькі атамы азоту і серы, якія ўваходзяць у склад гетэрацыкла, а таксама кіслародныя атамы карбаміднае і карбаксільнае груп [[Біяцін|біяціна]]. Яны бяруць удзел у стварэньні васьмі вадародных злучэньняў паміж [[Біяцін|біяцінам]] і бакавымі ланцугамі амінакіслотных рэштак у актыўным цэнтры стрэптавідзіна (малюнак 1.4б). [[Біяцін|Біяцін]] апускаецца досыць глыбока ў актыўны цэнтрцэнтар стрэптавідзіна, так, што вонкі выступаюць толькі адзін з азотаў гетэрацыкла і абодва кісларода карбаксільнае групы [105]<ref>Hendrickson, W. A., Pahler, A., Smith, J. L., Satow, Y., Merritt, E. A., and Phizackerley, R. P. (1989) Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation, Proc Natl Acad Sci U S A 86, 2190-2194.</ref>. Asn23, Ser27, Tyr43 утвораюць вадародныя сувязі c карбамідным атамам кіслароду, Asp128 - з N1-атамам карбаміднага кальца, а Ser45 - c N2-атамам гэтага ж кальца. Карбаксільная група [[Біяцін|біяціна]] ўдзельнічае ў стварэньні дзвюхдзьвюх вадародных сувязяў - з Asn49 і Ser88, атам серы - з Thr90, а пентанаільная група дзякуючы гідрафобным узаемадзеяннямузаемадзеяньням злучаецца з Trp120 [106]<ref>Sano, T., and Cantor, C. R. (1995) Intersubunit contacts made by tryptophan 120 with biotin are essential for both strong biotin binding and biotin-induced tighter subunit association of streptavidin, Proc Natl Acad Sci U S A 92, 3180-3184.</ref>. Усе сувязі, якія утвараюцца, маюць даўжыню 2,63 - 3,37 А (малюнак 1.3б).

Ва ўтварэньні біяцінзьвязваючага сайта бяруць удзел таксама араматычныя амінакіслоты Tyr43, Trp79, Trp92, Trp108 і Trp120, якія фарміруюць "гідрафобную скрынку" [104]<ref>Livnah, O., Bayer, E. A., Wilchek, M., and Sussman, J. L. (1993) Three-dimensional structures of avidin and the avidin-biotin complex, Proc Natl Acad Sci U S A 90, 5076-5080.</ref>, прычым Trp120 належыць прылегламу манамеру малекулы стрэптавідзіна. Іншыя два Trp21 і Trp75 ня ўдзельнічаюць у злучэннізлучэньні ліганда (малюнак 1.4а).

Аднак гідрафобныя і гідрафільныя ўзаемадзеянніўзаемадзеяньні паміж [[Біяцін|біяцінам]] і стрэптавідзінам у поўнай меры не тлумачаць высокае падабенства [[Бялкі|бялку]] і ліганда. Знойдзена, што ў момант комплексаўтварэньня адбываюцца таксама зменызьмены другаснай, троеснай і чацвярцічнайчацьвярцічнай структураў стрэптавідзіна. Працэс злучэннязлучэньня ўключае структурныя зменызьмены [[Бялкі|бялку]], якія павялічваюць ступень камплементарнасцікамплементарнасьці паміж унутранай паверхняй біяцінзьвязваючага сайта і лігандам, і суправаджаецца выцясненнемвыцясьненьнем пяці малекул вады з актыўнага цэнтра. Пры гэтым адна ззь петляў (анг. "loop"), так званая стрэптавідынавая звязваючаязьвязваючая пятля, (рэшткі 45-52), размешчанаяразьмешчаная паміж трэцім і чацвёртымчацьвёртым атосамі антыпаралельнага складкавага {beta}-ліста манамераў стрэптавідзіна [107]<ref>Freitag, S., Le Trong, I., Klumb, L., Stayton, P. S., and Stenkamp, R. E. (1997) Structural studies of the streptavidin binding loop, Protein Sci 6, 1157-1166.</ref>, загінаецца над звязваючымзьвязваючым сайтам і замыкае ў ім [[Біяцін|біяцін]].

ЗвязваючаяЗьвязваючая пятля можа быць у дзвюхдзьвюх розных канфармацыях - адкрытай і зачыненай. У агульным выпадку, зачыненая канфармацыя прымаецца ў выпадку наяўнасцінаяўнасьці [[Біяцін|біяціна]] ў звязваючымзьвязваючым сайце. Пры яго адсутнасціадсутнасьці звязваючаязьвязваючая пятля знаходзіцца ў неспарадкаваным стане. Такім чынам, канфармацыя пятлі ўвесь час змяняеццазьмяняецца, і яе нельга ўсталяваць метадаммэтадам радыёграфіі ў крышталях. Адзначым, што некаторыя даследчыкідасьледчыкі лічаць, што адкрытая ці зачыненая канфармацыя стрэптавідзінавае звязваючаезьвязваючае пятлі не залежыць ад наяўнасцінаяўнасьці ў біяцінзьвязваючым цэнтры [[Біяцін|біяціна]] [107]<ref>Freitag, S., Le Trong, I., Klumb, L., Stayton, P. S., and Stenkamp, R. E. (1997) Structural studies of the streptavidin binding loop, Protein Sci 6, 1157-1166.</ref>.

Акрамя вышэйапісаных зменаўзьменаў стрэптавідзінавай звязваючайзьвязваючай пятлі, малекула [[Бялкі|бялку]] ў цэлым становіцца больш кампактнай, што пацвярджаеццапацьвярджаецца зніжэннемзьніжэньнем хуткасціхуткасьці абмену цяжкага і лёгкага вадароду паміж стрэптавідзінам і растваральнікам [108]<ref>Williams, D. H., Stephens, E., and Zhou, M. (2003) Ligand binding energy and catalytic efficiency from improved packing within receptors and enzymes, J Mol Biol 329, 389-399.</ref>.

Тетрамер стрэптавідзіна можна разглядаць як "дымер дымераў" двух тыпаў: функцыянальных і структурных. Для ўтварэньня актыўнага біяцінзьвязваючага сайта важна функцыянальнае ўзаемадзеяннеўзаемадзеяньне паміж субадзінкамі 1 і 2 ці 3 і 4 (малюнак 1.2б). Галоўным пасроднікам гэтых узаемадзеянняўузаемадзеяньняў выступае Trp120, які лакалізоўваецца ў пятле паміж сёмым і восьмым {beta}-атосамі. Ён фармуе частку актыўнага цэнтра суседняй субадзінкі, і наадварот. Таму дымер, які складаецца з субадзінак 1 і 2 (3 і 4), з'яўляеццазьяўляецца функцыянальным. ЗлучэннеЗлучэньне з [[Біяцін|біяцінам]] прыводзіць да асацыяцыі штучна атрыманых манамераў прыроднага кора стрэптавідзіна, прычым ключавую ролю ў самазборцы мае Trp120. Мутантавы стрэптавідзін, які мае замену Trp120 на Phe ці любую іншую амінакіслату, не фарміруе ды- і тэтрамеры ў прысутнасціпрысутнасьці [[Біяцін|біяціна]] і характарызуецца зніжанымзьніжаным падабенствам да ліганда (Ka~(1-3)?108 М-1) [92, 106]<ref>Bayer, E. A., Kulik, T., Adar, R., and Wilchek, M. (1995) Close similarity among streptavidin-like, biotin-binding proteins from Streptomyces, Biochim Biophys Acta 1263, 60-66.</ref> <ref>Sano, T., and Cantor, C. R. (1995) Intersubunit contacts made by tryptophan 120 with biotin are essential for both strong biotin binding and biotin-induced tighter subunit association of streptavidin, Proc Natl Acad Sci U S A 92, 3180-3184.</ref>. Такім чынам, у стварэньні біяцінзьвязваючага сайта вельмі важнымі зьяўляюцца ўзаемадзеянніўзаемадзеяньні паміж манамерамі.

Структурныя дымеры фарміруюцца паміж манамерамі 1 і 4 (2 і 3) за кошт трох вадародных сувязяў. Паверхня кантакту, якая змяшчаезьмяшчае толькі па тры амінакіслотных рэшткі субадзінак 1 і 3 (2 і 4), утвараюць разам з функцыянальнымі парамі манамераў аб'яднаную дымер-дымерную паверхню. Нягледзячы на свой невялікі памер, паверхня паміж 1 і 3 (2 і 4) важная для стабільнасцістабільнасьці алігамернай формы стрэптавідзіна [108]<ref>Williams, D. H., Stephens, E., and Zhou, M. (2003) Ligand binding energy and catalytic efficiency from improved packing within receptors and enzymes, J Mol Biol 329, 389-399.</ref>.

Замена некаторых амінакіслотных рэштак, якія лакалізуюцца на паверхні бялковай малекулы і не прымаюць непасрэднага ўдзелу ў зьвязваньні [[Біяцін|біяціна]], прыводзіць да значнага зніжэннязьніжэньня функцыянальнай актыўнасціактыўнасьці стрэптавідзіна. Да іх належаць, напрыклад, важныя амінакіслотныя рэшткі, якія фарміруюць паверхню, якая кантактуе з трыма іншымі субадзінкамі - Ala65, змешчанызьмешчаны ў завесе паміж 4 і 5 атосамі, Leu124 і Val125. Акрамя таго, замена Trp21, Trp75, His87, Asn85, Lys80, Arg84, гэта значыць рэштак, што не прымаюць удзел у фармавіраваньні актыўнага цэнтра, прыводзіць да поўнай ці істотнай страты здольнасціздольнасьці злучаць вітамін Н. У той жа час, замена некаторых амінакіслотаў, якія ўтвараюць вадародныя сувязі з [[Біяцін|біяцінам]], напрыклад, Ser27Ala, Tyr43Phe, Ser45Ala, не з'яўляеццазьяўляецца крытычнай для праявы біяцінзьвязваючай актыўнасціактыўнасьці [94]<ref>Laitinen, O. H., Hytonen, V. P., Nordlund, H. R., and Kulomaa, M. S. (2006) Genetically engineered avidins and streptavidins, Cell Mol Life Sci 63, 2992-3017.</ref>. Thr114 і Leu124 цікавыя ззь іншых пазіцыйпазыцый. Яны размешчаныразьмешчаны ў вельмі абмежаванай прасторы на паверхні [[Бялкі|бялку]]. Таму іх замена на амінакіслоты з больш аб'ёмнымі бакавымі радыкаламі замінае правільнаму фолдынгу стрэптавідзіна [94]<ref>Laitinen, O. H., Hytonen, V. P., Nordlund, H. R., and Kulomaa, M. S. (2006) Genetically engineered avidins and streptavidins, Cell Mol Life Sci 63, 2992-3017.</ref>. І, наадварот, замена на амінакіслоты ззь меншым бакавым радыкалам (Ala, Gly) прыводзіць да павелічэнняпавелічэньня біяцінзьвязваючай актыўнасціактыўнасьці ў параўнанніпараўнаньні ззь дзікім тыпам.

Цікава, што стрэптавідзін здольны злучаць неня толькі [[Біяцін|біяцін]] і яго вытворныя, але і пептыды, якія змяшчаюцьзьмяшчаюць матыў His-Pro-Gln [108]<ref>Williams, D. H., Stephens, E., and Zhou, M. (2003) Ligand binding energy and catalytic efficiency from improved packing within receptors and enzymes, J Mol Biol 329, 389-399.</ref>. Гэта ўласцівасцьўласьцівасьць з поспехампосьпехам была скарыстаная ва ўдасканаленым фагавым дысплеі [109]<ref>Meyer, S. C., Gaj, T., and Ghosh, I. (2006) Highly selective cyclic peptide ligands for NeutrAvidin and avidin identified by phage display, Chem Biol Drug Des 68, 3-10.</ref>.

Акрамя таго, стрэптавідзін з Kd парадку 10-4 M злучае канкуруючы з [[Біяцін|біяцінам]] фарбавальнік 2-(4-гідроксіазабензол)бензойную кіслату (2-(4-hydroxyazobenzoic acid, HABA), адначасова абескаляроўваючы яго. Пры выцясненнівыцясьненьні [[Біяцін|біяцінам]] ці яго вытворнымі дадзены фарбавальнік ізноў афарбоўваецца ў ярка-памяранцавы колер. Гэта ўласцівасцьўласьцівасьць шырока выкарыстоўваецца ў шматлікіх канструкцыях для вызначэннявызначэньня колькасных характарыстак злучэннязлучэньня.

==ФізікаФізыка-хімічныя ўласцівасьціўласьцівасьці стрэптавідзіну==

РастваральнасцьРастваральнасьць стрэптавідзіна ў вадзе залежыць ад наяўнасцінаяўнасьці ў яго структуры амінакіслотных рэштак да 21 і пасляпасьля 130 палажэньняў. Поўнапамерная форма, якая складаецца з амінакіслотных рэштак 1-159, дрэнна растваральная ў вадзе [90]<ref>Green, N.M. Avidin and streptavidin / N.M. Green // Methods Enzymol. - 1990. - Vol. 184, № - P. 51-67.</ref>, тады як водны раствор штучнага фрагментафрагмэнта, што ўключае амінакіслотныя рэшткі 21-130, можна сканцэнтраваць нават да 110 г/л (2,1 мм) [102]<ref>Pahler, A., Hendrickson, W. A., Kolks, M. A., Argarana, C. E., and Cantor, C. R. (1987) Characterization and crystallization of core streptavidin, J Biol Chem 262, 13933-13937.</ref>. Прыродны коравы стрэптавідзін (рэшткі 13-139) і іншыя формы з даўжэйшымі поліпептыднымі ланцугамі маюць прамежкавую растваральнасцьрастваральнасьць [110]<ref>Sano, T., Pandori, M. W., Chen, X., Smith, C. L., and Cantor, C. R. (1995) Recombinant core streptavidins. A minimum-sized core streptavidin has enhanced structural stability and higher accessibility to biotinylated macromolecules, J Biol Chem 270, 28204-28209.</ref>.

Малекула стрэптавідзіна характарызуецца высокай стабільнасцюстабільнасьцю. Бялок не дэнатуруе ў 6 М мачавіне і вельмі павольна дэнатуруецца пад ўздзеяннемўзьдзеяньнем 6 М гуанідзін-гідрахларыда (guanidine hydrochloride). Стрэптавідзін з'яўляеццазьяўляецца значна больш устойлівым да шматлікіх дэнатуруючых уздзеянняўузьдзеяньняў, чым большасцьбольшасьць іншых [[Бялкі|бялкоў]], уключаючы авідын. Толькі такі моцны денатурант, як 6 М гуанідзін ціацыянат (Guanidinium thiocyanate), выклікае незваротную дэнатурацыю стрэптавідзіна (1,3 М - пасляпасьля 5 дзён, 1 М - 39 дзён інкубацыі). АдсутнасцьАдсутнасьць у складзе стрэптавідзіна рэштак цыстэіна прадухіляе утварэньне папярочных сшывак, якія могуць зменшыцьзьменшыць верагоднасцьверагоднасьць рэфолдзінгу. Тым неня менш, пасляпасьля кантакту з гуанідзін-ціацыянатам аднаўляецца толькі дзведзьве траціны зыходнае біяцінзьвязваючае здольнасціздольнасьці стрэптавідзіна.

Комплекс стрэптавідзіна з [[Біяцін|біяцінам]] значна больш устойлівы ў адносінах да тэмпературнайтэмпэратурнай дэнатурацыі, чым вольны стрэптавідзін, прычым стабільнасцьстабільнасьць прама прапарцыйна залежыць ад ступені насычанасцінасычанасьці біяцінзьвязваючых цэнтраў (табліца 1.3, малюнак 1.5). Біяцінзьвязваючая актыўнасцьактыўнасьць захоўваецца ў прысутнасціпрысутнасьці ДДС-Na (нават пры 60С), а таксама ў растворы 6 М мачавіны. Бялок устойлівы да награваннянаграваньня, дзеяннюдзеяньню высокіх і нізкіх значэнняўзначэньняў рН і шматлікіх пратэялітычных ферментаў [111]<ref>Laitinen, O. H., Nordlund, H. R., Hytonen, V. P., and Kulomaa, M. S. (2007) Brave new (strept)avidins in biotechnology, Trends Biotechnol 25, 269-277.</ref>.

Кожны манамер стрэптавідзіна мае ў сваім складзе шэсцьшэсьць трыптафанаў, таму бялок характарызуецца высокім каэфіцыентам экстынкцыі Е280 нм, 1 г/л = 3,4 [112]<ref>Bayer, E. A., and Wilchek, M. (1990) Application of avidin-biotin technology to affinity-based separations, J Chromatogr 510, 3-11.</ref>. Па чатыры рэшткі трыптафану знаходзіцца ў біяцінзьвязваючых цэнтрах. ЗлучэннеЗлучэньне [[Біяцін|біяціна]] прыводзіць да значных змензьмен у трыптафанавае флуарэсцэнцыі стрэптавідзіна. Пры гэтым адбываецца зрух максімуму ў караткахвалевую вобласцьвобласьць і памяншаецца інтэнсіўнасцьінтэнсіўнасьць флуарэсцэнцыі. Пры поўным насычэннінасычэньні ўсіх біяцінзьвязваючых цэнтраў зрух роўны 5 нм, а інтэнсіўнасцьінтэнсіўнасьць флуарэсцэнцыі змяншаеццазьмяншаецца на 25% [113]<ref>Gonzalez, M., Bagatolli, L. A., Echabe, I., Arrondo, J. L., Argarana, C. E., Cantor, C. R., and Fidelio, G. D. (1997) Interaction of biotin with streptavidin. Thermostability and conformational changes upon binding, J Biol Chem 272, 11288-11294.</ref>. ЗменыЗьмены флуоресцентныхфлуоресьцентных уласцівасцяўуласьцівасьцяў галоўным чынам выкліканы канфармацыйнымі зменамізьменамі [[Бялкі|бялку]]. Зрух максімуму эмісіі ў караткахвалевую вобласцьвобласьць пры злучэннізлучэньні [[Біяцін|біяціна]] абумоўлены зменамізьменамі мікраасяроддзямікраасяродзьдзя трыптафанілаў з-за павелічэнняпавелічэньня кампактнасцікампактнасьці макрамалекулы, а зніжэннезьніжэньне інтэнсіўнасціінтэнсіўнасьці флуарэсцэнцыі - экранаваннемэкранаваньнем [[Біяцін|біяцінам]] рэштак трыптафану актыўнага цэнтра.

Усталявана, што асноўны ўнёсак у агульную інтэнсіўнасцьінтэнсіўнасьць эмісіі стрэптавідзіна пры эксцітэнцыіэксьцітэнцыі святломсьвятлом з даўжынёй хвалі 295 нм уносяць трыптафаны звязваючыхзьвязваючых сайтаў кожнага манамера. Гэта пацвярджаюцьпацьвярджаюць вынікі эксперыментаўэкспэрымэнтаў па тушэннітушэньні трыптафанавае флуарэсцэнцыі стрэптавідзіна нейтральнымнэўтральным тушыльгікам акрыламідам. У вольным стрэптавідзіне адбываецца тушэннетушэньне флуарэсцэнцыі без зруху максімуму эмісіі, што паказвае на аднолькавую даступнасцьдаступнасьць усіх трыптафанаў для тушыльніка. Пры тытраваннітытраваньні акрыламідам насычанага комплексу стрэптавідзін-[[Біяцін|біяцін]] уласная [[флуарэсцэнцыя бялку]] тушыцца зусім трошкі. Больш высокія значэннізначэньні ўяўных канстант дынамічнага тушэннятушэньня Штерна-Фольмера Кsv(уяў.) і статычнага тушэннятушэньня V(уяў.) [113]<ref>Gonzalez, M., Bagatolli, L. A., Echabe, I., Arrondo, J. L., Argarana, C. E., Cantor, C. R., and Fidelio, G. D. (1997) Interaction of biotin with streptavidin. Thermostability and conformational changes upon binding, J Biol Chem 272, 11288-11294.</ref> былі разлічаныразьлічаны для вольнага стрэптавідзіна ў параўнанніпараўнаньні са стрэптавідзінам, насычаным [[Біяцін|біяцінам]] (табліца 1.4).

Канфармацыйная прырода змензьмен, якія адбываюцца ў малекуле стрэптавідзіна пасляпасьля стварэньня комплексу з [[Біяцін|біяцінам]] пацвярджаеццапацьвярджаецца таксама памяншэннемпамяншэньнем амаль у два разу часу эмісіі святласьвятла трыптафаніламі. У прысутнасціпрысутнасьці акрыламіду час жыццяжыцьця флуарэсцэнцыі стрэптавідзіна памяншаецца на 30%, у той час як для стрэптавідзін-біяцінавага комплексу гэты параметрпарамэтар застаецца практычна нязменнымнязьменным (табліца 1.4).

Тэтрамерны стрэптавідзін, у адрозненнеадрозьненьне ад вольных субадзінак, дрэнна афарбоўваецца Кумасі дыяментавым блакітным (малюнак 1.5). Гэта звязаназьвязана са значна больш высокай ступеннюступеньню кампактызацыі тэтрамера [113, 114]<ref>Gonzalez, M., Bagatolli, L. A., Echabe, I., Arrondo, J. L., Argarana, C. E., Cantor, C. R., and Fidelio, G. D. (1997) Interaction of biotin with streptavidin. Thermostability and conformational changes upon binding, J Biol Chem 272, 11288-11294.</ref> <ref>Sano, T., and Cantor, C. R. (1990) Cooperative biotin binding by streptavidin. Electrophoretic behavior and subunit association of streptavidin in the presence of 6 M urea, J Biol Chem 265, 3369-3373.</ref>.

У літаратуры найболей ахарактарызавана электрафарэтычная рухомасцьрухомасьць прэпаратаў стрэптавідзіна (вольнага і ў комплексе з [[Біяцін|біяцінам]]) у ПААГ у прысутнасціпрысутнасьці ДДС-Na і 6 М мачавіны.

ПрысутнасцьПрысутнасьць мачавіны ў растворы стрэптавідзіна выклікае некалькі эфектаўэфэктаў. З аднаго боку, мачавіна ў высокіх канцэнтрацыях з'яўляеццазьяўляецца моцным дэнатуруючым (хаатропным) агентам у стаўленністаўленьні да [[Бялкі|бялкоў]], ззь іншага боку, малекула мачавіны структурна роднасная карбаміднае групоўцы ў адным з цыклаў [[Біяцін|біяціна]]. У адсутнасцьадсутнасьць ліганда мачавіна замяшчае малекулы вады, якія займаюць біяцінзьвязваючы цэнтрцэнтар стрэптавідзіна з Кd у інтэрвале (3,6-12)?10-2 М, выклікаючы слабыя канфармацыйныя зменызьмены, якія стабілізуюць стрэптавідзін. Таму ў адрозненнеадрозьненьне ад большасцібольшасьці [[Бялкі|бялкоў]], электрафарэтычная рухомасцьрухомасьць якіх прыкметна памяншаецца ў 6 М мачавіне, стрэптавідзін у асяроддзіасяродзьдзі гэтага хаатропнага агента захоўвае электрафарэтычныя ўласцівасціўласьцівасьці, характэрныя для натыўных умоваў [113, 114]<ref>Gonzalez, M., Bagatolli, L. A., Echabe, I., Arrondo, J. L., Argarana, C. E., Cantor, C. R., and Fidelio, G. D. (1997) Interaction of biotin with streptavidin. Thermostability and conformational changes upon binding, J Biol Chem 272, 11288-11294.</ref> <ref>Sano, T., and Cantor, C. R. (1990) Cooperative biotin binding by streptavidin. Electrophoretic behavior and subunit association of streptavidin in the presence of 6 M urea, J Biol Chem 265, 3369-3373.</ref>.

[[Біяцін|Біяцін]] выцясняевыцясьняе слаба злучаную мачавіну, ініцыюючы значна глыбейшыя канфармацыйныя зменызьмены, якія робяць малекулу стрэптавідзіна больш элептычнай і кампактнай і абумаўляюць высокі стабілізуючы эфектэфэкт. Акрамя таго, [[Біяцін|біяцін]] з'яўляеццазьяўляецца арганічнай кіслатой (pI~3,5), і яго злучэннезлучэньне змяняезьмяняе агульны зарад стрэптавідзіна на больш адмоўны. Вынікам апісанага вышэй спалучэнняспалучэньня ўздзеянняўўзьдзеяньняў з'яўляеццазьяўляецца павелічэннепавелічэньне рухомасцірухомасьці комплексу [[Біяцін|біяцін]]-стрэптавідзін у параўнанніпараўнаньні з вольным стрэптавідзінам падчас электрафарэзу ў ПААГ у прысутнасціпрысутнасьці 6 М мачавіны (малюнак 1.6).

Супярэчлівыя вынікі прыведзены ў літаратуры адносна ўплыва звязваньнязьвязваньня стрэптавідзінам [[Біяцін|біяціна]] на рухомасцьрухомасьць комплекса ў ПААГ у адсутнасціадсутнасьці мачавіны [113 114 115]<ref>Gonzalez, M., Bagatolli, L. A., Echabe, I., Arrondo, J. L., Argarana, C. E., Cantor, C. R., and Fidelio, G. D. (1997) Interaction of biotin with streptavidin. Thermostability and conformational changes upon binding, J Biol Chem 272, 11288-11294.</ref> <ref>Sano, T., and Cantor, C. R. (1990) Cooperative biotin binding by streptavidin. Electrophoretic behavior and subunit association of streptavidin in the presence of 6 M urea, J Biol Chem 265, 3369-3373.</ref> <ref>Jones, M. L., and Kurzban, G. P. (1995) Noncooperativity of biotin binding to tetrameric streptavidin, Biochemistry 34, 11750-11756.</ref>.

==МетадыМэтады выдзяленьня стрэптавідзіну==

Ачыстка стрэптавідзіна, сінтэзаванагасынтэзаванага ў клеткавай культуры, з'яўляеццазьяўляецца ключавым этапам тэхналёгіі атрыманняатрыманьня [[Бялкі|бялку]], прызначанага для імабілізацыі на цьвёрдае фазе ці кан'югіраваньня ззь ферментамі. Апісана мноства спосабаў выдзяленьня стрэптавідзіна з культуральнае вадкасьці S. avidinii ці клеткавых сістэмсыстэм экспрэсіі [[Бялкі рэкамбінантныя|рэкамбінантнага бялку]], заснаваных на традыцыйных методыках бялковай хіміі [116 117 118]<ref>Jia, W., Huang, J., and Meng, W. (1995) [Identification of streptavidin], Hua Xi Yi Ke Da Xue Xue Bao 26, 436-438.</ref> <ref>Suter, M., Cazin, J., Jr., Butler, J. E., and Mock, D. M. (1988) Isolation and characterization of highly purified streptavidin obtained in a two-step purification procedure from Streptomyces avidinii grown in a synthetic medium, J Immunol Methods 113, 83-91.</ref> <ref>Bayer, E. A., Ben-Hur, H., Gitlin, G., and Wilchek, M. (1986) An improved method for the single-step purification of streptavidin, J Biochem Biophys Methods 13, 103-112.</ref> ці афіннай храматаграфіі [119 120 121 122]<ref>Gallizia, A., de Lalla, C., Nardone, E., Santambrogio, P., Brandazza, A., Sidoli, A., and Arosio, P. (1998) Production of a soluble and functional recombinant streptavidin in Escherichia coli, Protein Expr Purif 14, 192-196.</ref> <ref>Sorensen, H. P., Sperling-Petersen, H. U., and Mortensen, K. K. (2003) A favorable solubility partner for the recombinant expression of streptavidin, Protein Expr Purif 32, 252-259.</ref> <ref>Avrantinis, S. K., Stafford, R. L., Tian, X., and Weiss, G. A. (2002) Dissecting the streptavidin-biotin interaction by phage-displayed shotgun scanning, Chembiochem 3, 1229-1234.</ref> <ref>Zischler, H., Nanda, I., Schafer, R., Schmid, M., and Epplen, J. T. (1989) Digoxigenated oligonucleotide probes specific for simple repeats in DNA fingerprinting and hybridization in situ, Hum Genet 82, 227-233.</ref>. СтварэннеСтварэньне высокаэфектыўныхвысокаэфэктыўных штамаў-прадуцэнтаў рэкамбінантнага стрэптавідзіна [100, 122 123 124]<ref>Nagarajan, V., Ramaley, R., Albertson, H., and Chen, M. (1993) Secretion of streptavidin from Bacillus subtilis, Appl Environ Microbiol 59, 3894-3898.</ref> <ref>Zischler, H., Nanda, I., Schafer, R., Schmid, M., and Epplen, J. T. (1989) Digoxigenated oligonucleotide probes specific for simple repeats in DNA fingerprinting and hybridization in situ, Hum Genet 82, 227-233.</ref> <ref>Schwidop, W. D., Klossek, P., Muller, R., and Claus, R. (1990) Procedure for the purification of streptavidin by hydrophobic interaction chromatography, J Chromatogr 520, 325-331.</ref> <ref>Klein, C. P., de Groot, K., Vermeiden, J. P., and van Kamp, G. (1980) Interaction of some serum proteins with hydroxylapatite and other materials, J Biomed Mater Res 14, 705-712.</ref> і яго біяцінзьвязваючых фрагментаўфрагмэнтаў [125]<ref>Akhrem, A. A., and Drozhdenyuk, A. P. (1989) Calcium tartrate gel, Anal Biochem 179, 86-89.</ref> істотна спрасціласпрасьціла працэдуру атрыманняатрыманьня актыўных прэпаратаў. Аднак, нягледзячы на поспехіпосьпехі ў атрыманніатрыманьні рэкамбінантных аналогаў, прыродны стрэптавідзін у наш час шырока выкарыстоўваецца, напрыклад, у вытворчасцівытворчасьці сучасных дыягнастычных сродкаў.

БольшасцьБольшасьць апісаных у літаратуры спосабаў выдзяленнявыдзяленьня чыстага стрэптавідзіна з КВ заснаваныя на храматаграфіях - афіннай [126]<ref>Freitag, R., and Hilbrig, F. (2007) Use of the avidin (imino)biotin system as a general approach to affinity precipitation, Methods Mol Biol 418, 35-50.</ref>, аніёнаабменнай [116]<ref>Jia, W., Huang, J., and Meng, W. (1995) [Identification of streptavidin], Hua Xi Yi Ke Da Xue Xue Bao 26, 436-438.</ref> і гідрафобнай [117]<ref>Suter, M., Cazin, J., Jr., Butler, J. E., and Mock, D. M. (1988) Isolation and characterization of highly purified streptavidin obtained in a two-step purification procedure from Streptomyces avidinii grown in a synthetic medium, J Immunol Methods 113, 83-91.</ref>. Распрацаваныя і нехраматаграфічныя метадымэтады выдзяленнявыдзяленьня, якія ўключаюць у якасціякасьці галоўных стадыяў селектыўную сорбцыю [[Бялкі|бялкоў]] на оксіапатыце і іншых фасфатах кальцыя [127]<ref>Garret-Flaudy, F., and Freitag, R. (2000) Use of the avidin (imino)biotin system as a general approach to affinity precipitation, Biotechnol Bioeng 71, 223-234.</ref>, а таксама тартраце кальцыя [128]<ref>Hirsch, J. D., Eslamizar, L., Filanoski, B. J., Malekzadeh, N., Haugland, R. P., Beechem, J. M., and Haugland, R. P. (2002) Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation, Anal Biochem 308, 343-357.</ref>, ужываннеужываньне термоўляганнятермоўляганьня полі-N-ізапрапілакрыламіда, мадыфікаванага па канцавых N-амінагрупам [[Імінабіяцін|2-імінабіяціна]] [129-130]<ref>Nordlund, H. R., Hytonen, V. P., Laitinen, O. H., and Kulomaa, M. S. (2005) Novel avidin-like protein from a root nodule symbiotic bacterium, Bradyrhizobium japonicum, J Biol Chem 280, 13250-13255.</ref> <ref>Helppolainen, S. H., Nurminen, K. P., Maatta, J. A., Halling, K. K., Slotte, J. P., Huhtala, T., Liimatainen, T., Yla-Herttuala, S., Airenne, K. J., Narvanen, A., Janis, J., Vainiotalo, P., Valjakka, J., Kulomaa, M. S., and Nordlund, H. R. (2007) Rhizavidin from Rhizobium etli: the first natural dimer in the avidin protein family, Biochem J 405, 397-405.</ref>. Добрыя вынікі дае і неспецыфічнаенеспэцыфічнае ўляганнеўляганьне сульфатам амонія пры ўмове, што акцінаміцэты выгадоўваліся ў сінтэтычнымсынтэтычным асяроддзіасяродзьдзі [118]<ref>Bayer, E. A., Ben-Hur, H., Gitlin, G., and Wilchek, M. (1986) An improved method for the single-step purification of streptavidin, J Biochem Biophys Methods 13, 103-112.</ref>. На першым этапе атрыманняатрыманьня стрэптавідзіна рэкамендуюцьрэкамэндуюць улічваць той факт, што пры старэнністарэньні культуры назіраецца зменазьмена механізмаўмэханізмаў [[Посттрансляцыйная мадыфикацыя|посттрансляцыйнайпосттрансьляцыйнай мадыфікацыі]] [[Бялкі|бялку]]; гэта чыніць парушэнніпарушэньні пратэоліза стрэптавідзіна і прыводзіць да стварэннястварэньня вялікамалекулярных агрэгатаў [101]<ref>Bayer, E. A., Ben-Hur, H., Hiller, Y., and Wilchek, M. (1989) Postsecretory modifications of streptavidin, Biochem J 259, 369-376.</ref>, што значна змяншаезьмяншае выйсцевыйсьце актыўнага прадукта.

У лабараторнайлябараторнай практыцы найбольш часта ўжываецца афінная слупковая храматаграфія на сарбентах з імабілізаванымі вытворнымі [[Біяцін|біяціна]] [119, 131]<ref>Gallizia, A., de Lalla, C., Nardone, E., Santambrogio, P., Brandazza, A., Sidoli, A., and Arosio, P. (1998) Production of a soluble and functional recombinant streptavidin in Escherichia coli, Protein Expr Purif 14, 192-196.</ref> <ref>Hytonen, V. P., Laitinen, O. H., Grapputo, A., Kettunen, A., Savolainen, J., Kalkkinen, N., Marttila, A. T., Nordlund, H. R., Nyholm, T. K., Paganelli, G., and Kulomaa, M. S. (2003) Characterization of poultry egg-white avidins and their potential as a tool in pretargeting cancer treatment, Biochem J 372, 219-225.</ref>. У якасціякасьці афіннага ліганда часцейчасьцей за ўсё выкарыстоўваюць [[Імінабіяцін|імінабіяцін]], падабенства якога да стрэптавідзіна крытычна залежыць ад рН асяроддзяасяродзьдзя. Пры рН 11 Кd мае парадак 10-8 М, у той час як пры рн 4,0 [[Імінабіяцін|імінабіяцін]] цалкам губляе падабенства да стрэптавідзіна. Гэта зьвязана са з'яўленнемзьяўленьнем зарада ў гуанідынавае групы [[Імінабіяцін|імінабіяціна]] ў кіслых умовах (малюнак 1.7).

===СістэмыСыстэмы для выяўленьня===

===СістэмыСыстэмы для выдзяленьня===

===СістэмыСыстэмы для медыцынскіх мэтаў===